基于16S的细菌群落功能预测工具Tax4Fun2

回想第一次接触微生物组分析时是2017年，那会儿主流的两个基于16S的细菌群落功能预测工具就是PICRUSt和Tax4Fun，均可以获得类似于宏基因组的功能丰度数据。不过当时来看Tax4Fun更推荐一些，Tax4Fun以 SILVA数据库的物种注释为基础（支持115、119和123三个版本，对应的程序最后一次更新是2015年，当时仅时隔2年），而PICRUSt以GreenGene数据库的物种注释为基础（最后更新是2013年，当时已时隔4年）。并且当时SILVA已经取代GreenGene成为了主流的16S细菌物种注释库，最后小编选择了Tax4Fun作分析。

其实再往后来看，这两个工具所依据的数据库也已经很老了。现在是2020年，SILVA都更新到138版本了，即便再使用Tax4Fun也很勉强（Tax4Fun最高仅支持SILVA123，但是再返回使用旧的数据库注释明显不是一个好选择）。

当然，生信工具也是与时俱进的。为了满足如今的所需，PICRUSt和 Tax4Fun都推出了全新版本，即PICRUSt2和Tax4Fun2。PICRUSt2的使用请参考隔壁的推文，本篇简介Tax4Fun2。 

评估微生物群落的功能和冗余度是环境微生物学的主要挑战。Tax4Fun2是一个R程序包，可基于16S rRNA基因序列快速预测原核生物的功能谱和功能冗余。通过合并用户定义的、特定于栖息地的基因组信息，可以显著提高预测功能图谱的准确性和鲁棒性（Wemheuer et al, 2018）。与旧版Tax4Fun相比，Tax4Fun2的具有如下优点。

（1）不再局限于仅SILVA的特定版本注释的OTU丰度表，允许直接以OTU代表序列作为输入，通过与指定参考数据库的比对实现物种注释。除了Tax4Fun2提供的已构建好的参考集（相比之前大幅扩大），也允许我们提供自定义的参考集，使用非常灵活。

（2）侧重于原核数据，但也可以合并真核数据。

（3）提供了计算特定功能冗余的方法，对于预测特定功能在环境扰动期间丢失的可能性至关重要。

（4）精度和稳定性显著提升。

（5）目前Tax4Fun2仍处于不断的更新状态。

Tax4Fun2的工作流程。首先将16S rRNA基因序列与参考序列（可以为内置的，也允许使用用户自定义的）进行比对，以识别最近的邻居。根据最近邻居搜索的结果，汇总各样本的OTU丰度。一个关联矩阵（AM）包含在16S rRNA搜索中识别的参考功能概况。整合OTU丰度与AM功能谱，预测每个样品的宏基因组。

下文继续简介Tax4Fun2的使用。如果想了解关于旧版Tax4Fun的内容，可参考前文。

Tax4Fun2官方文档：https://github.com/bwemheu/Tax4Fun2

下文部分测试结果文件及R代码等，可在百度盘获取（提取码：kr9p）：

https://pan.baidu.com/s/1nogKmaDSnexF34_WlfEWng

Tax4Fun2安装及配置

本篇的所有操作都是在linux平台下进行的，包括程序包的安装及测试过程。Windows或Mac平台下的方法可能存在不同，我未再尝试，大家若有需要可参考官方文档的说明。

参考自：https://github.com/bwemheu/Tax4Fun2

#下载 tax4fun2 程序包，shell 命令行
wget https://github.com/bwemheu/Tax4Fun2/releases/download/1.1.5/Tax4Fun2_1.1.5.tar.gz

然后打开R，手动安装Tax4Fun2程序包（它是一个R包）。

#安装 tax4fun2
install.packages(pkgs = 'Tax4Fun2_1.1.5.tar.gz', repos = NULL, source = TRUE)
 
#加载
library(Tax4Fun2)

随后，需要配置Tax4Fun2依赖环境，包括参考数据库，以及功能实现的其它R包或程序等。总体上来说安装无任何难度，都是命令行傻瓜式安装的。

加载Tax4Fun2包后，使用内部函数buildReferenceData()下载并构建默认的Tax4Fun2参考数据库，以及检查是否需要安装ape和seqinr包。此外，它还将测试用户PATH中是否存在blastn，为了确保下载成功，该功能还将使用md5sums自动检查下载数据的一致性。

#下载并构建默认的 Tax4Fun2 参考数据库
#path_to_working_directory='.'，Tax4Fun2 默认在当前工作路径中构建库，如有需要，通过该参数指定位置
#use_force=FALSE，是否覆盖已有的文件夹，默认为 FALSE
#install_suggested_packages=TRUE，安装 ape 和 seqinr 包，默认为 TRUE
buildReferenceData(path_to_working_directory = '.', use_force = FALSE, install_suggested_packages = TRUE)

等待一会儿，执行成功后，可在当前工作路径下看到生成新路径“Tax4Fun2_ReferenceData_v2”，即为当前构建的Tax4Fun2参考数据库。在随后的功能预测环节，物种注释、基因组功能预测等，将通过这些库文件实现。

安装依赖，该函数将下载blast（v2.9.0）的当前最新版本，并将二进制程序放置在Tax4Fun2参考库路径中。另外，它还将测试ape和seqinr包是否可用。

#安装依赖
#path_to_working_directory，默认值为在当前工作路径中构建的库，如有需要，通过该参数指定位置
#use_force=FALSE，是否覆盖已有的文件夹，默认为 FALSE
#install_suggested_packages=TRUE，安装 ape 和 seqinr 包，默认为 TRUE
buildDependencies(path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    use_force = FALSE, install_suggested_packages = TRUE)

Tax4Fun2参考数据库路径“Tax4Fun2_ReferenceData_v2”中，新添加了blast程序。

Tax4Fun2预测细菌群落功能

接下来，测试Tax4Fun2的使用。

默认过程参考自：https://github.com/bwemheu/Tax4Fun2

1、测试数据集

使用官方提供的数据集测试。

#此命令将自动下载 Tax4Fun2 测试数据
#path_to_working_directory='.'，自动下载到当前工作路径下，如有需要，通过该参数指定位置
getExampleData(path_to_working_directory = '.')

或者在以下链接手动获取（此外，我在网盘中也保存了一份）。

https://cloudstor.aarnet.edu.au/plus/s/4htgFinDIpzOuKK/download

通过如上命令获取后，这些测试数据自动下载到当前工作路径（以下除“Tax4Fun2_ReferenceData_v2”外，都是）。

接下来使用其中两个重要的文件。

“KELP_otu_table.txt”，就是常说的OTU丰度表（尽管它不是以OTU作为命名，但在习惯上，请允许我继续这样称呼），仅OTU ID及其在各样本（列）中的丰度信息，无OTU注释列。

“KELP_otus.fasta”，即各OTU的代表16S rRNA序列，fasta文件。

2、群落功能预测

第一步，物种注释

可以看到，和旧版Tax4Fun相比，新版Tax4Fun2中不再要求输入带SILVA特定版本注释的OTU丰度表。Tax4Fun2中，将使用提供的OTU代表16S rRNA序列，和已构建好的参考数据库中的已知物种的16S rRNA序列进行比对（默认调用blastn程序实现），根据相似性获得物种注释。

#物种注释
#指定 OTU 代表序列、Tax4Fun2 库的位置、参考数据库版本、序列比对（blastn）线程数等
runRefBlast(path_to_otus = 'KELP_otus.fasta', path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    path_to_temp_folder = 'Kelp_Ref99NR', database_mode = 'Ref99NR', 
    use_force = TRUE, num_threads = 4)

Tax4Fun2参考库“Tax4Fun2_ReferenceData_v2”中，有SILVA、NR库等可选（不妨自己点开看一下），上述使用了Ref99NR。

运行等待一会儿后，工作路径下获得“Kelp_Ref99NR”，存放了比对结果，输入序列和库中目标序列的最佳匹配。

第二步，KEGG Orthology（KO）功能及代谢途径丰度预测

在获得物种注释后，继续根据物种基因组的功能特征，结合OTU丰度表给出的物种丰度信息，推断群落功能丰度。

#预测群落功能
#指定 OTU 丰度表、Tax4Fun2 库的位置、参考数据库版本、上步的物种注释结果路径等
makeFunctionalPrediction(path_to_otu_table = 'KELP_otu_table.txt', path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    path_to_temp_folder = 'Kelp_Ref99NR', database_mode = 'Ref99NR', 
    normalize_by_copy_number = TRUE, min_identity_to_reference = 0.97, normalize_pathways = FALSE)
 
#或者
makeFunctionalPrediction(path_to_otu_table = 'KELP_otu_table.txt', path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    path_to_temp_folder = 'Kelp_Ref99NR', database_mode = 'Ref99NR', 
    normalize_by_copy_number = TRUE, min_identity_to_reference = 0.97, normalize_pathways = TRUE)

normalize_by_copy_number=TRUE，对于很多细菌而言，一个个体可能包含多条16S（多拷贝16S），因此推荐在原始OTU 16S rRNA丰度表的基础上，根据物种所含16S rRNA拷贝数对物种丰度进行标准化，得到校正16S rRNA拷贝数后的OTU丰度表后进行功能丰度映射。

normalize_pathways=FALSE，将每个KO的相对丰度关联到它所属的每个pathway；normalize_pathways=TRUE，每个KO的相对丰度平均分配给分配给它的所有pathway。

最后获得两个结果文件，如下所示。

“functional_prediction.txt”，预测到的功能基因在各样本中的相对丰度，功能基因映射到KO功能中（即KO第4级分类单元）。根据KO ID及功能描述信息，若有感兴趣的，可在KEGG官网（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）查询获得更多细节。

“pathway_prediction.txt”，将功能基因丰度映射到其所属的代谢途径（KEGG pathway，即KO第3级分类单元）中，获得各样本中各pathway的相对丰度。在这里也能看到Tax4Fun2和早期版本的Tax4Fun相比的一个改进点，就是将这些pathway所属的更高级KO分类单元也给了出来，方便我们归类分析；而早期版本的Tax4Fun中是没有这些高级分类信息的（通常还需手动添加，我在前文Tax4Fun教程中也提到了手动添加到方法）。

3、统计分析

获得群落功能丰度表后，就可以按照OTU丰度表的统计分析方法，去执行类似的分析了。这点可以找一些文献作参考，看别人是怎样做的。例如，首先计算特定功能丰度在组间的显著性，获得组间差异显著的功能，然后再从数据库官网上查询该功能的细节，解释生物学现象等。

Tax4Fun2的其它实用功能

除了基于16S rRNA丰度的细菌群落功能预测，Tax4Fun2还提供了其它很多实用功能。上述我们下载了Tax4Fun2的示例数据。除了OTU丰度表以及OTU代表序列外，还有很多其它文件，继续使用这些示例数据作展示。

同样地，参考自：https://github.com/bwemheu/Tax4Fun2

构建自定义参考集

Tax4Fun2还允许我们自定义构建参考集，充分体现了它的灵活性。

1、提取SSU序列

指定一个单一物种基因组序列fasta文件，或者包含多个基因组fasta文件的文件夹。基因组序列中必须含有至少一个拷贝的16S rRNA基因序列，运行命令可获取其中的16S rRNA序列，并删除“空”基因组。

#提取 SSU 序列，16S rRNA 
#给定单个基因组
extractSSU(genome_file = 'OneProkaryoticGenome.fasta', file_extension = 'fasta', 
    path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2')
 
#给定多个基因组
extractSSU(genome_folder = 'MoreProkaryoticGenomes', file_extension = 'fasta', 
    path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2')

2、为原核基因组分配功能

类似地，指定一个单一物种基因组序列fasta文件，或者包含多个基因组fasta文件的文件夹。Tax4Fun2将调用prodigal、diamond blast等程序，实现类似原核物种基因组功能注释的过程。

#为原核基因组分配功能
#给定单个基因组
assignFunction(genome_file = 'OneProkaryoticGenome.fasta', file_extension = 'fasta', 
    path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', num_of_threads = 1, fast = TRUE)
 
#给定多个基因组
assignFunction(genome_folder = 'MoreProkaryoticGenomes/', file_extension = 'fasta', 
    path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', num_of_threads = 1, fast = TRUE)

3、生成参考数据

提取SSU序列以及完成基因组功能分配后，对于每个给定的基因组至少获得两个文件：一个记录SSU序列，一个记录功能注释概况。最后指定这些文件所在的文件夹并提供正确的文件扩展名，生成最终数据集。

#生成参考数据，文档中提供了 3 种方法
#推荐选择第二种，该命令包含一个 uclust 聚类步骤，可消除数据中的冗余
# 1) Generate user-defined reference data without uclust from a single genome
generateUserData(path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', path_to_user_data = '.', 
    name_of_user_data = 'User_Ref0', SSU_file_extension = '_16SrRNA.ffn', KEGG_file_extension = '_funPro.txt')
 
# 2) Generate user-defined reference data without uclust
generateUserData(path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', path_to_user_data = 'MoreProkaryoticGenomes', 
    name_of_user_data = 'User_Ref1', SSU_file_extension = '_16SrRNA.ffn', KEGG_file_extension = '_funPro.txt')
 
# 3) Generate user-defined reference data without uclust
generateUserDataByClustering(path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', path_to_user_data = 'MoreProkaryoticGenomes', 
    name_of_user_data = 'User_Ref2', SSU_file_extension = '_16SrRNA.ffn', KEGG_file_extension = '_funPro.txt', use_force = TRUE)

计算（多）功能冗余指数（functional redundancy indices，FRI）

计算KEGG功能的系统发育分布（高FRI->高冗余度，低FRI ->低冗余度，并可能随群落变化而丢失）。

##计算（多）功能冗余指数（FRIs）
#OTU 代表序列与数据库参考序列的 blast
runRefBlast(path_to_otus = 'Water_otus.fna', path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    path_to_temp_folder = 'Water_Ref99NR', database_mode = 'Ref99NR', use_force = TRUE, num_threads = 4)
 
#计算 FRIs 值
calculateFunctionalRedundancy(path_to_otu_table = 'Water_otu_table.txt', path_to_reference_data = './Tax4Fun2_ReferenceData_v2', 
    path_to_temp_folder = 'Water_Ref99NR', database_mode = 'Ref99NR', min_identity_to_reference = 0.97)

参考文献

Wemheuer F, Taylor J A, Daniel R, et al. Tax4Fun2: a R-based tool for the rapid prediction of habitat-specific functional profiles and functional redundancy based on 16S rRNA gene marker gene sequences. bioRxiv, 2018.

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